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记住这几点,免疫组化实验效果加倍!

记住这几点,免疫组化实验效果加倍!

 

一、为达到免疫组织化学技术的要求,组织固定越新鲜越好。

在免疫组化zui后结果的判断时,常可见到均匀一片的似非特异性染色的现象,经多方研究认为,它是一种假性非特异性的染色。因为肿瘤组织中含有的抗原较易发生扩散弥散,肿瘤细胞无限制的生长和生长过速,导致肿瘤中间部分组织血液供给困难,造成缺血坏死,坏死细胞中的抗原由于机体的作用,可以被均匀地散布于细胞与细胞间的间质,这是抗原发生弥散的一种方式。另一种抗原弥散的方式就是,由于组织没有及时的固定所引起的。离体的组织不及时固定,组织就会自溶,抗原就会扩散,这是一非常普通的常识,但要做好却是极不容易。标本从外科切除到浸入固定液需要经过一段时间,在这段时间里,有的抗原就可以发生扩散。虽然已浸入了固定液,但标本较大,固定液的量又不足,当然由于固定液的渗透需要时间,当渗入到组织之中时,中间的细胞已发生了变化,抗原也随着发生扩散,这种现象在产酶多的器官是比较明显的,如胃癌,当切除后标本较大,虽然在手术室期间已放入了固定液,但固定液要透过肌层达到胃粘膜面起码需要几个小时的时间,当固定液发挥作用时,组织已经发生变化。因此,这了达到免疫组织化学染色的要求,对于离体的组织尽量快的进行固定,有条件的应将其剖开,早取材,早固定。

二、组织脱水必须彻底干净
组织块取材不能太大过厚,才能较好地完成脱水的过程。如果取材太厚,在较短的时间内脱水不完全,将可引起一系列的问题,比如浸蜡不彻底,切片不好完成,切不完整。由于先天不足,导致后来切片染色的脱落,造成染色的失败,或者由此反复操作,造成年人力物力的浪费,造成病理报告的延期发出等。因此,对取材的要求是除了要求要有艺术性外,即平整、外观好看,还要求适中。

三、切片必须完整、均匀、平展、无邹折
应用于免疫组织化学染色的切片,对切片的质量要求较高,切片必须完整,平展、无汽泡,无邹折,这样有利在染色时的冲洗,有利于切片的牢固附贴。如果切片不平展,免疫组化染色后,可出现染色不均匀的现象,颜色深浅不一, 不平。如果切片有汽泡切片在烘烤时,由于汽泡的破裂影响了汽泡周围的组织,在其周围可观察到深浅不一的染色。如果切片有邹折,免疫组化染色后,在邹折的地方有深浅不一的颜色,这是一种假阳性,容易引走混淆。

四、切片的附贴必须牢固,必须使用合适的粘贴剂。
免疫组织化学染色前的前期准备工作,就是必须对新的载玻片进行处理,新的载玻片表面看起来很干净,有人认为不需要进行任何的处理,都能够适合使用,这是一种错误的想法。新出厂的载玻片,表面复盖着开一层油脂样的物质,如果不加以处理,对切片的附贴是极为不利的。我们的做法是:新的载玻片,放于玻璃清洗液中浸泡4小时甚至过夜,然后取出,经自来水彻底冲洗后,浸入酒精中达2小时以上,取出擦干备用或烘干也可。然后再将载玻片浸入了-氨基-三乙氧基-硅烷(3-Aminopropyl triethoxy-silane)的稀释液(1:50用丙酮或无水乙醇稀释都可以)中硅化10分钟,后经无水乙醇洗2次,烘干即可使用。

五、切片必须烘烤附贴牢固,既要经得起抗原修复时高温的作用而不使轻易脱片,又不至于破坏抗原。
应用于免疫组化染色的切片。由于整个过程需经几个阶段的处理,如抗原修复时抗原修复液的沸腾且需持续十几分钟,PBS的反复冲洗,有的甚至于4℃冰箱中孵育达十几小时。因此,对切片的质量要求很高,尤其是切片的附贴程度。以往有人主张切片在60℃以下烘烤30-60分钟即可按此进行结果是切片掉片严重,切片松动率占100%。切片究竟烘烤多长时间才合适,既不脱片和适合各项要求,又不至于破坏抗原。几组实验[]诊断P173认为,切片在60℃的恒温干燥箱中烘烤2-5小时zui为合适。这是因为:抗原可耐受如此的温度,病理科一般使用的石蜡,其熔点在60℃左右,组织浸蜡时,浸蜡箱中的温度,一般都调在65℃左右,组织在这样温度中要浸泡2小时以上,才能达到彻底地浸蜡。组织中的抗原已经受了65℃的温度考验,保存下来的抗原,都已具有耐热性。另外,经上述时间烘烤出来的切片,附贴牢固,抗原保存好,染色成功率达100%,保证了病理诊断的及时性和准确性。
特需要注意的是,不管是应用于诊断的切片还是研究用的切片,烘烤后应尽快进行染色。如果切片切完后,迟迟不进行染色,存放于室温中或工作冰箱中,切片中的抗原将会随着时间的延长而逐渐消失,甚至出现假阴性。原则上是新鲜切片,即行染色,染多少张切多少张,这样才能尽可能的保存表达更多的抗原。

六、切片脱蜡必须干净,否则将会影响免疫组化染色的zui后结果。
蜡不溶于水,不与其它的临床使用的抗体相融合。它只能靠特用的试剂,处理足够的时间,才能将其除去。如果脱蜡不干净,少许蜡存留于切片上,将会引起许多弊病,如染色不均匀,阳性物时隐时现,真假难辨,背景染色增加等。为了解决上述的问题,切片在染色前必须彻底脱蜡,目前用于脱蜡的试剂主要是二甲苯,因它脱蜡力强,脱蜡时间较短。较受使用者的青睐。脱蜡的时间要根据季节,室温和试剂的新鲜谋面是在不同。如果在夏天,室温较高,脱蜡试剂也新鲜,则脱蜡时间不需很多,3-5分钟就已足够。如果在冬天,室温较低,脱蜡试剂也较陈旧,则脱蜡时间需要延长,10-20分钟或更长。总之,操作时应根据不同的季节,不同的室温,不同的试剂来决定,脱蜡的时间,原则上是要彻底,干净,完全地脱去切片上的蜡。为了做到这一步,切片在脱蜡前的加温将有助于完成上述的要求。比如:当天切的切片,烧烤2小时后进行染色,切片带有温度进行脱蜡这将可加速脱蜡的过程,如果预先切好烤好的切片,在染色前,还必须对切片进行加温10-20分钟,然后再行脱蜡,这样脱蜡速度加快,效果魁伟更好

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