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产品名称:实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验代测

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产品特点:上海信帆生物提供实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验代测服务,代测时间为7-10天,提供实验数据,动力扩增曲线,包括所有试剂,提供分析数据、步骤等,如果你想了解该实验服务的详细信息,咨询!

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实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验代测的详细资料:

实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验代测

1.聚合酶链反应(英文全称:Polymerase Chain Reaction),简称PCR。聚合酶链反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火(复性)及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方.聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,简称PCR)又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。Real -Time PCR,即实时监测PCR扩增产物并进行解析的方法,它是在PCR反应体系中加入荧光物质,并通过Real -Time PCR检测系统对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时监测,zui终对实验数据进行分析处理的方法。Real -Time PCR自1996年由美国Applied Biosystems公司推出以来,广泛应用于生物研究的各个领域。目前主要有SYBR Green 染料、Taqman探针法两种。

实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验代测

2 方法

2.1 组织总RNA的提取

1)取组织或者细胞于1mLTrizol的匀浆管中,于匀浆机匀浆20sec,立即放于冰上;

2)置于超净台中,温育5min12000r/min,离心10min

3)吸上清于新的1.5mL离心管中,加入200μL的氯仿,摇匀,室温静置2min4℃,12000r/min,离心10min

4)吸取上清于新的1.5mL离心管中,加入600μL的异丙醇,混合均匀,室温静置15min4℃,12000r/min,离心15min,弃上清;

5)加入1mL75%的无水乙醇(750μL无水乙醇+250μL DEPC水)漂洗沉淀,4℃,12000r/min,离心5min,弃上清;

6)加入1mL无水乙醇,漂洗沉淀,4℃,12000r/min,离心5min,弃上清,室温干燥10min

7)加入40μLDEPC水溶解RNA,置于-80℃冰箱保存备用。

2.2 cDNA*条链的合成

2.2.1  RNADNA的消除

DNaseⅠ:


1μL

10×DNase Buffer


1μL

RNA


1ng

DEPC-H2O


   nμL

总体积:


10μL

37℃,30minHold,加1μLEDTA65℃,10min

2.2.2 反转录

(1)按以下体系加入:

RNA-Primer Mix

12μL

5×RT Reaction Buffer

5μL

25mM dNTPs

1μL

25U/μL RNase Inhibitor  

1μL

200U/μL M-MLV Rtase

1μL

Oligodt18

1μL

ddH2O(DNase-free)

4μL

总体积:

25μL

反应程序:37℃,60min85℃,5min4℃,5min;置于-20℃保存。

2.3 Real-time PCR扩增

将制备好的cDNA进行PCR扩增,扩增体系如下:

SYBRGreen Mix       12.5μL

上游引物F            0。5μL

下游引物R            0.5μL

ddH2O 9.5μL

cDNA模板 2μL

总体积 25μL

反应程序:

95 10min95℃,15Sec60℃,45Sec×4095,15 Sec 60,1min95,15 Sec60, 15 Sec

数据采用仪器自带软件分析:ABI Prism 7300 SDS Software

实验结果

提供实验原始数据

cytochrome c mRNA扩增动力学曲线



如果你想了解更多关于该实验的详细信息,咨询!


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